Uvod
L-fenilacetilkarbinol je spojina, ki se uporablja pri sintezi efedrina, ki se sam uporablja kot predhodnik amfetaminov. Industrijsko se sintetizira z aerobno fermentacijo benzaldehida s pekovskim kvasom (S. cerevisiae/SC). Čeprav je postopek precej preprost, lahko zahteva nekaj opreme in znanja, zlasti ko govorimo o vzdrževanju sterilnih kultur in ustreznih pogojev rasti. Zato bom razložil dve različno zapleteni metodi za proizvodnjo L-PAC z biotransformacijo. Rastno gojišče je treba pred uporabo sterilizirati z avtoklaviranjem.
Prva metoda:
To tehniko bi lahko opisali kot "površno, a enostavno". Zahteva manj opreme, je lažja, vendar je tudi manj učinkovita in bo povzročila manjše donose.
Postopek:
V 500 ml sterilnega 0,1M citratnega pufra pH 6 dodajte 44 g kvasa in 55 g glukoze. Postavimo v vodno kopel, segreto na 30 °C. Inkubiramo 40/50 minut.
Dodajte benzaldehid (25 mmol) v 5 ml etanola in acetaldehid (25 mmol). Inkubiramo 60 minut.
Filtriramo skozi celit.
Ekstrakcija s 3*100 ml etil acetata. Emulzijo razbijemo z nasičeno raztopino natrijevega klorida, posušimo nad brezvodnim natrijevim sulfatom, filtriramo, izparimo topilo. To je vaš L-PAC.
Razlage:
Citratni pufr: uporablja se za vzdrževanje stabilnega pH, saj ga rast celice čez čas zniža (kar ni dobro). Za pripravo tega pufra upoštevajte postopke, ki jih navaja ta kalkulator: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Ne pozabite spremeniti pH na 6.
Temperatura: omogoča večjo presnovno aktivnost kvasovk.
Etanol: uporablja se za raztapljanje benzaldehida in acetaldehida ter povečuje njuno biološko razpoložljivost.
Acetaldehid: uporablja se kot akceptor vodika namesto benzaldehida, s čimer se omeji proizvodnja benzilalkohola.
To je enostaven postopek, ki ga lahko izvede skoraj vsakdo po nekaj branja o standardnih sterilnih tehnikah, vendar daje nižje izkoristke kot drugi postopek (med 20 in 40 %). Izboljšamo ga lahko z boljšim zračenjem z orbitalnim stresanjem pri 150 vrtljajih na minuto ali s črpanjem sterilnega zraka v gojišče, in sicer 1 L zraka na liter gojišča na minuto, ali z imobilizacijo celic v alginatnih kroglicah. To si lahko ogledate na youtubu, saj je zelo enostavno in lahko znatno poveča donose.
Druga metoda:
Ta protokol je bolj napreden, vendar lahko ob pravilni izvedbi poveča izkoristek do 60 ali 70 %. Vendar pa bo za to potrebnih več materiala. Čeprav ni popoln, je veliko boljši.
Ta metoda je bila zasnovana za kvasovko Candida utilis namesto za S. cerevisiae. Namesto nje lahko uporabite SC, vendar se bodo donosi zmanjšali. C. utilis lahko kupite tukaj: https: //www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Postopek:
Gojišče je sestavljeno iz 10 g/L sečnine (dušik), 10 g/L MgSO4 (magnezij in žveplo) in od 50 do 70 g/L sladkorja iz melase. Raztopimo v ustrezni količini 0,1M citratnega pufra s pH 6.
Dan prej inokulirajte začetno kulturo kvasovk in jo čez noč inkubirate pri 30 °C.
Odčitamo optično gostoto (absorbanco) pri 595 nm. Fermentacijski reaktor inokulirajte s 15 % v/v izhodiščne kulture, prilagojene na 0,4 OD. Primer: če je bila izmerjena vrednost OD 0,2, za inokulacijo 1L posode dodajte 300 mL na 700 mL. Če je OD že 0,4, dodajte 150 ml na 850 ml itd... (240x106 celic/ml v inokulu, glejte razlago)
Inkubirajte pri 30 °C z orbitalnim stresanjem pri 150 vrtljajih na minuto ali črpanjem sterilnega zraka s hitrostjo 1 v/v/min. Če črpate zrak, boste morda želeli dodati nekaj počasnega mešanja.
Inkubirajte, dokler OD ne doseže vrednosti med 0,3 in 0,4. To naj bi trajalo od 4 do 6 ur, lahko tudi manj ali več. Vsakih 30 minut preverite OD, dokler ne dosežete želene vrednosti.
Dodajanje benzaldehida poteka v več odmerkih. Za 50 ml so količine 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Istočasno dodajte enakovreden volumen acetaldehida. Med vsakim dodajanjem počakajte eno uro.
Ekstrakcijo izvedemo z uporabo toluena/medija v/v v razmerju 1:2 in izparevamo.
Razlaga:
Optična gostota: izmerimo jo s spektrofotometrom. Pri tem odčitamo absorbanco pri 595 nm, ki je sorazmerna s številom celic v raztopini. Pravilo: 0,1 OD=60x10^6 celic/mL
Splošne opombe:
Za zračenje je v manjšem obsegu boljše orbitalno stresanje pri 150 vrtljajih na minuto. V večjem obsegu boste morali uporabiti zrak, ki ga boste spustili skozi filter.
V drugem protokolu je dodajanje benzaldehida izvedeno v več odmerkih, da se poveča izkoristek. To se lahko še izboljša z neprekinjenim vbrizgavanjem benzaldehida v padajočem odmerku, vendar je to v amaterskem okolju zapleteno.
Uporabijo se lahko tudi substituirani benzaldehidi, pri čemer se pridobi ustrezen analog L-PAC.
Na koncu si lahko izposodite nekatere elemente metode 2 in jih vključite v metodo 1, da prilagodite načrt poskusa po svojih željah. Zavedajte se, da lahko uporabite tudi druge seve in vrste, kar znatno poveča izkoristek. Za več informacij glej "Production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in melasses and sugar cane juice as production medium", Ravi et al.
L-fenilacetilkarbinol je spojina, ki se uporablja pri sintezi efedrina, ki se sam uporablja kot predhodnik amfetaminov. Industrijsko se sintetizira z aerobno fermentacijo benzaldehida s pekovskim kvasom (S. cerevisiae/SC). Čeprav je postopek precej preprost, lahko zahteva nekaj opreme in znanja, zlasti ko govorimo o vzdrževanju sterilnih kultur in ustreznih pogojev rasti. Zato bom razložil dve različno zapleteni metodi za proizvodnjo L-PAC z biotransformacijo. Rastno gojišče je treba pred uporabo sterilizirati z avtoklaviranjem.
Prva metoda:
To tehniko bi lahko opisali kot "površno, a enostavno". Zahteva manj opreme, je lažja, vendar je tudi manj učinkovita in bo povzročila manjše donose.
Postopek:
V 500 ml sterilnega 0,1M citratnega pufra pH 6 dodajte 44 g kvasa in 55 g glukoze. Postavimo v vodno kopel, segreto na 30 °C. Inkubiramo 40/50 minut.
Dodajte benzaldehid (25 mmol) v 5 ml etanola in acetaldehid (25 mmol). Inkubiramo 60 minut.
Filtriramo skozi celit.
Ekstrakcija s 3*100 ml etil acetata. Emulzijo razbijemo z nasičeno raztopino natrijevega klorida, posušimo nad brezvodnim natrijevim sulfatom, filtriramo, izparimo topilo. To je vaš L-PAC.
Razlage:
Citratni pufr: uporablja se za vzdrževanje stabilnega pH, saj ga rast celice čez čas zniža (kar ni dobro). Za pripravo tega pufra upoštevajte postopke, ki jih navaja ta kalkulator: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Ne pozabite spremeniti pH na 6.
Temperatura: omogoča večjo presnovno aktivnost kvasovk.
Etanol: uporablja se za raztapljanje benzaldehida in acetaldehida ter povečuje njuno biološko razpoložljivost.
Acetaldehid: uporablja se kot akceptor vodika namesto benzaldehida, s čimer se omeji proizvodnja benzilalkohola.
To je enostaven postopek, ki ga lahko izvede skoraj vsakdo po nekaj branja o standardnih sterilnih tehnikah, vendar daje nižje izkoristke kot drugi postopek (med 20 in 40 %). Izboljšamo ga lahko z boljšim zračenjem z orbitalnim stresanjem pri 150 vrtljajih na minuto ali s črpanjem sterilnega zraka v gojišče, in sicer 1 L zraka na liter gojišča na minuto, ali z imobilizacijo celic v alginatnih kroglicah. To si lahko ogledate na youtubu, saj je zelo enostavno in lahko znatno poveča donose.
Druga metoda:
Ta protokol je bolj napreden, vendar lahko ob pravilni izvedbi poveča izkoristek do 60 ali 70 %. Vendar pa bo za to potrebnih več materiala. Čeprav ni popoln, je veliko boljši.
Ta metoda je bila zasnovana za kvasovko Candida utilis namesto za S. cerevisiae. Namesto nje lahko uporabite SC, vendar se bodo donosi zmanjšali. C. utilis lahko kupite tukaj: https: //www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Postopek:
Gojišče je sestavljeno iz 10 g/L sečnine (dušik), 10 g/L MgSO4 (magnezij in žveplo) in od 50 do 70 g/L sladkorja iz melase. Raztopimo v ustrezni količini 0,1M citratnega pufra s pH 6.
Dan prej inokulirajte začetno kulturo kvasovk in jo čez noč inkubirate pri 30 °C.
Odčitamo optično gostoto (absorbanco) pri 595 nm. Fermentacijski reaktor inokulirajte s 15 % v/v izhodiščne kulture, prilagojene na 0,4 OD. Primer: če je bila izmerjena vrednost OD 0,2, za inokulacijo 1L posode dodajte 300 mL na 700 mL. Če je OD že 0,4, dodajte 150 ml na 850 ml itd... (240x106 celic/ml v inokulu, glejte razlago)
Inkubirajte pri 30 °C z orbitalnim stresanjem pri 150 vrtljajih na minuto ali črpanjem sterilnega zraka s hitrostjo 1 v/v/min. Če črpate zrak, boste morda želeli dodati nekaj počasnega mešanja.
Inkubirajte, dokler OD ne doseže vrednosti med 0,3 in 0,4. To naj bi trajalo od 4 do 6 ur, lahko tudi manj ali več. Vsakih 30 minut preverite OD, dokler ne dosežete želene vrednosti.
Dodajanje benzaldehida poteka v več odmerkih. Za 50 ml so količine 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Istočasno dodajte enakovreden volumen acetaldehida. Med vsakim dodajanjem počakajte eno uro.
Ekstrakcijo izvedemo z uporabo toluena/medija v/v v razmerju 1:2 in izparevamo.
Razlaga:
Optična gostota: izmerimo jo s spektrofotometrom. Pri tem odčitamo absorbanco pri 595 nm, ki je sorazmerna s številom celic v raztopini. Pravilo: 0,1 OD=60x10^6 celic/mL
Splošne opombe:
Za zračenje je v manjšem obsegu boljše orbitalno stresanje pri 150 vrtljajih na minuto. V večjem obsegu boste morali uporabiti zrak, ki ga boste spustili skozi filter.
V drugem protokolu je dodajanje benzaldehida izvedeno v več odmerkih, da se poveča izkoristek. To se lahko še izboljša z neprekinjenim vbrizgavanjem benzaldehida v padajočem odmerku, vendar je to v amaterskem okolju zapleteno.
Uporabijo se lahko tudi substituirani benzaldehidi, pri čemer se pridobi ustrezen analog L-PAC.
Na koncu si lahko izposodite nekatere elemente metode 2 in jih vključite v metodo 1, da prilagodite načrt poskusa po svojih željah. Zavedajte se, da lahko uporabite tudi druge seve in vrste, kar znatno poveča izkoristek. Za več informacij glej "Production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in melasses and sugar cane juice as production medium", Ravi et al.
