Technologie genetyczne, które wkroczyły w ludzkie życie pod koniec ubiegłego wieku, zmieniły nasz świat do tego stopnia, że już teraz nie sposób wyobrazić sobie go bez nich. Technologie te zdołały również przeniknąć do kryminalistyki; od dziesięcioleci identyfikacja genetyczna jest wykorzystywana jako szybka i stosunkowo tania metoda, która pozwala znaleźć przestępców i rozwiązać ich czyny bez opuszczania laboratorium. Jako farmakolog z wykształcenia, jestem bardzo zainteresowany genetyką i chętnie badam tę dziedzinę w jej różnych aspektach. W tej publikacji przedstawię klasyczne podejścia genetyczne w dziedzinie kryminalistyki.
Trochę historii, czyli co to ma wspólnego z rycerzami?
150 lat temu Johannes Friedrich Miescher odkrył kwasy nukleinowe, koncepcję, która ostatecznie wywróciła świat do góry nogami [1]. W połowie XX wieku stało się jasne, że DNA i RNA są nośnikami informacji dziedzicznej; następnie opisano ich strukturę, a nieco później pojawiły się liczne metody pozwalające na "cięcie" tych cząsteczek in vitro za pomocą enzymów komórkowych - restryktaz [2]; ich amplifikację za pomocą PCR [3]; a nawet odczytywanie sekwencji konkretnych genów i genomów za pomocą wielu metod sekwencjonowania [4].
Początkowo praca z materiałem genetycznym była wykonywana dosłownie "w kuchni" i nie zawsze mogła być odtworzona nawet w sąsiednim laboratorium naukowym. Czas jednak mijał, podejście się zmieniało, a metody zostały ustandaryzowane do tego stopnia, że stopniowo wprowadzano je do badań stosowanych, a nawet produkcji biotechnologicznej.
W 1984 r. społeczność naukową poruszyła wiadomość, że naukowcom udało się wyizolować i odczytać fragment DNA zebry Burchella, która wymarła i przetrwała jedynie w zbiorach muzealnych [5]. Rok później szwedzki genetyk Svante Pääbo potwierdził możliwość wykorzystania materiałów muzealnych i archeologicznych do fundamentalnych badań naukowych, po raz pierwszy analizując materiał genetyczny egipskich mumii. Po latach okazało się, że analizowane przez niego próbki były zanieczyszczone współczesnym materiałem genetycznym [6], ale rozwój metod sekwencjonowania nadal umożliwiał pracę nawet z minimalnymi ilościami słabo zachowanego DNA.
Kryminalistycy również byli zainteresowani nowymi technikami analizy materiału genetycznego. Faktem jest, że metody klasycznej daktyloskopii i analizy grup krwi, które były zwyczajowe w tym czasie, miały swoje ograniczenia, aw niektórych przypadkach były nieskuteczne.
W 1984 roku brytyjski naukowiec Sir Alec John Jeffreys (rysunek 3) opracował i przedstawił metodę identyfikacji osoby na podstawie jej materiału genetycznego. Później podejście to zostało nazwane identyfikacją DNA, zdobywając miłość i szacunek kryminologów na całym świecie. Za swoją pracę Jeffreys został pasowany na rycerza.
Trochę historii, czyli co to ma wspólnego z rycerzami?
150 lat temu Johannes Friedrich Miescher odkrył kwasy nukleinowe, koncepcję, która ostatecznie wywróciła świat do góry nogami [1]. W połowie XX wieku stało się jasne, że DNA i RNA są nośnikami informacji dziedzicznej; następnie opisano ich strukturę, a nieco później pojawiły się liczne metody pozwalające na "cięcie" tych cząsteczek in vitro za pomocą enzymów komórkowych - restryktaz [2]; ich amplifikację za pomocą PCR [3]; a nawet odczytywanie sekwencji konkretnych genów i genomów za pomocą wielu metod sekwencjonowania [4].
Początkowo praca z materiałem genetycznym była wykonywana dosłownie "w kuchni" i nie zawsze mogła być odtworzona nawet w sąsiednim laboratorium naukowym. Czas jednak mijał, podejście się zmieniało, a metody zostały ustandaryzowane do tego stopnia, że stopniowo wprowadzano je do badań stosowanych, a nawet produkcji biotechnologicznej.
W 1984 r. społeczność naukową poruszyła wiadomość, że naukowcom udało się wyizolować i odczytać fragment DNA zebry Burchella, która wymarła i przetrwała jedynie w zbiorach muzealnych [5]. Rok później szwedzki genetyk Svante Pääbo potwierdził możliwość wykorzystania materiałów muzealnych i archeologicznych do fundamentalnych badań naukowych, po raz pierwszy analizując materiał genetyczny egipskich mumii. Po latach okazało się, że analizowane przez niego próbki były zanieczyszczone współczesnym materiałem genetycznym [6], ale rozwój metod sekwencjonowania nadal umożliwiał pracę nawet z minimalnymi ilościami słabo zachowanego DNA.
Kryminalistycy również byli zainteresowani nowymi technikami analizy materiału genetycznego. Faktem jest, że metody klasycznej daktyloskopii i analizy grup krwi, które były zwyczajowe w tym czasie, miały swoje ograniczenia, aw niektórych przypadkach były nieskuteczne.
W 1984 roku brytyjski naukowiec Sir Alec John Jeffreys (rysunek 3) opracował i przedstawił metodę identyfikacji osoby na podstawie jej materiału genetycznego. Później podejście to zostało nazwane identyfikacją DNA, zdobywając miłość i szacunek kryminologów na całym świecie. Za swoją pracę Jeffreys został pasowany na rycerza.
Daktyloskopia DNA: zalety i wady
Analiza genetyczna próbek biologicznych uzyskanych na miejscach zbrodni znacznie uprościła pracę śledczych. Mają oni teraz niezawodne narzędzie do identyfikacji sprawcy lub ofiary, uzyskiwania niepodważalnych dowodów i rozwiązywania przestępstw.
Głównymi zaletami genetycznego pobierania odcisków palców jest możliwość pracy nawet z niewielkimi ilościami materiału biologicznego i wysoka dokładność, która pozwala na identyfikację osoby - jeśli wszystkie wymagania dotyczące analizy są spełnione, jej wiarygodność przekracza 99%. Podejście to stało się jednym z najważniejszych w badaniu przestępstw [7].
Należy zauważyć, że klasyczne metody daktyloskopii DNA nie pozwalają na identyfikację identycznych bliźniąt, których profil genetyczny jest taki sam, ponieważ powstają one z tej samej zapłodnionej komórki jajowej.
Do analizy DNA potrzebny jest przede wszystkim sam DnA, ale nie zawsze jest możliwe wyodrębnienie wysokiej jakości materiału genetycznego z próbek biologicznych, które zostały narażone na działanie czynników chemicznych i termicznych. W środowisku cząsteczka ta wchodzi w reakcje chemiczne, ulega zniszczeniu (fragmentacji) i modyfikacji, chociaż w sprzyjających warunkach może przetrwać tysiące lat [8].
Wiadomo, że najstarszy materiał genetyczny przodków człowieka został wyekstrahowany ze szczątków kostnych naszych humanoidalnych krewnych, którzy żyli na terytorium Półwyspu Iberyjskiego (Sierra de Atapuerca) około 430 tysięcy lat temu [9]. Specyficzny mikroklimat niektórych jaskiń o niskich wartościach wilgotności i temperatury znacznie wydłuża żywotność materiału genetycznego. Jednak DNA w próbkach znalezionych na miejscu przestępstwa jest często reprezentowane w minimalnych ilościach i, podobnie jak w próbkach archeologicznych, jest poważnie zdegradowane.
W Europie i Stanach Zjednoczonych zwraca się uwagę na inną wadę genetycznego pobierania odcisków palców, związaną z ingerencją w prywatność osoby i naruszeniem prywatności.
Obrońcy praw człowieka obawiają się, że informacje genetyczne przestępców i osób podejrzanych o popełnienie przestępstwa mogą wpaść w ręce osób trzecich, a następnie zostać niewłaściwie wykorzystane [10]. Na przykład znane są już przypadki wykorzystywania informacji genetycznych do kontrolowania mniejszości muzułmańskich w chińskiej prowincji Xinjiang.
Stany Zjednoczone również planują systematycznie gromadzić profile DNA imigrantów przebywających w areszcie federalnym [11]. Oczywiście obawy obrońców praw człowieka nie są bezpodstawne i mają realne podstawy.
Głównymi zaletami genetycznego pobierania odcisków palców jest możliwość pracy nawet z niewielkimi ilościami materiału biologicznego i wysoka dokładność, która pozwala na identyfikację osoby - jeśli wszystkie wymagania dotyczące analizy są spełnione, jej wiarygodność przekracza 99%. Podejście to stało się jednym z najważniejszych w badaniu przestępstw [7].
Należy zauważyć, że klasyczne metody daktyloskopii DNA nie pozwalają na identyfikację identycznych bliźniąt, których profil genetyczny jest taki sam, ponieważ powstają one z tej samej zapłodnionej komórki jajowej.
Do analizy DNA potrzebny jest przede wszystkim sam DnA, ale nie zawsze jest możliwe wyodrębnienie wysokiej jakości materiału genetycznego z próbek biologicznych, które zostały narażone na działanie czynników chemicznych i termicznych. W środowisku cząsteczka ta wchodzi w reakcje chemiczne, ulega zniszczeniu (fragmentacji) i modyfikacji, chociaż w sprzyjających warunkach może przetrwać tysiące lat [8].
Wiadomo, że najstarszy materiał genetyczny przodków człowieka został wyekstrahowany ze szczątków kostnych naszych humanoidalnych krewnych, którzy żyli na terytorium Półwyspu Iberyjskiego (Sierra de Atapuerca) około 430 tysięcy lat temu [9]. Specyficzny mikroklimat niektórych jaskiń o niskich wartościach wilgotności i temperatury znacznie wydłuża żywotność materiału genetycznego. Jednak DNA w próbkach znalezionych na miejscu przestępstwa jest często reprezentowane w minimalnych ilościach i, podobnie jak w próbkach archeologicznych, jest poważnie zdegradowane.
W Europie i Stanach Zjednoczonych zwraca się uwagę na inną wadę genetycznego pobierania odcisków palców, związaną z ingerencją w prywatność osoby i naruszeniem prywatności.
Obrońcy praw człowieka obawiają się, że informacje genetyczne przestępców i osób podejrzanych o popełnienie przestępstwa mogą wpaść w ręce osób trzecich, a następnie zostać niewłaściwie wykorzystane [10]. Na przykład znane są już przypadki wykorzystywania informacji genetycznych do kontrolowania mniejszości muzułmańskich w chińskiej prowincji Xinjiang.
Stany Zjednoczone również planują systematycznie gromadzić profile DNA imigrantów przebywających w areszcie federalnym [11]. Oczywiście obawy obrońców praw człowieka nie są bezpodstawne i mają realne podstawy.
Jak to działa
Metody daktyloskopii DNA opierają się na ludzkiej zmienności genetycznej. Substytucje nukleotydów w DNA (w zależności od częstotliwości występowania w populacji, są one również nazywane polimorfizmami DNA lub mutacjami) sprawiają, że różnimy się indywidualnie. Różnice te można znaleźć zarówno w genomach jądrowych, jak i mitochondrialnych, małych kolistych cząsteczkach DNA, które regulują funkcjonowanie mitochondriów, "fabryk" energii w komórkach.
Należy zauważyć, że polimorfizmy DNA można znaleźć w genomie każdego z nas - stają się one naszym unikalnym kodem kreskowym DNA. Niektóre z nich mogą powodować poważne choroby [12], ale w większości przypadków nie mają wpływu na nasze funkcje życiowe.
Nowoczesne metody daktyloskopii DNA wykorzystują różnorodne warianty genetyczne w różnych regionach genomu. Na przykład analiza powtórzeń tandemowych - krótkich powtarzających się sekwencji genomu, których liczba różni się u dwóch losowo wybranych osób [13] - pozwala na jednoznaczny test ojcostwa lub znalezienie dodatkowych dowodów przeciwko podejrzanemu o przestępstwo.
Markery Y-chromosomalnego DNA mogą być wykorzystane do określenia płci danej osoby. Markery genetyczne dostarczają informacji na temat pochodzenia etnicznego krewnych danej osoby, koloru oczu lub włosów.
Co więcej, informacje epigenetyczne (np. metylacja DNA) umożliwiają oszacowanie wieku biologicznego poszczególnych komórek, tkanek i organizmu jako całości [14]. W tym artykule omówię więcej powyższych metod analizy genetycznej. Natomiast wykorzystanie metod epigenetycznych w biznesie farmaceutycznym będzie tematem mojej kolejnej publikacji.
Markery Y-chromosomalnego DNA mogą być wykorzystane do określenia płci danej osoby. Markery genetyczne dostarczają informacji na temat pochodzenia etnicznego krewnych danej osoby, koloru oczu lub włosów.
Co więcej, informacje epigenetyczne (np. metylacja DNA) umożliwiają oszacowanie wieku biologicznego poszczególnych komórek, tkanek i organizmu jako całości [14]. W tym artykule omówię więcej powyższych metod analizy genetycznej. Natomiast wykorzystanie metod epigenetycznych w biznesie farmaceutycznym będzie tematem mojej kolejnej publikacji.
Pobieranie i izolacja DNA z materiału biologicznego
Ekstrakcja i analiza DNA z próbek kryminalistycznych jest na pierwszy rzut oka porównywalna ze sztuką. Czasami nie sposób sobie wyobrazić, że kilka kropel krwi lub kawałek skóry pod paznokciami ofiary może stać się najważniejszym dowodem w śledztwie kryminalnym.
W rzeczywistości działania specjalistów kryminalistyki na miejscu zbrodni są dopracowane i przebiegają według jednego scenariusza, którego jednym z głównych celów jest znalezienie materiału biologicznego nadającego się do ekstrakcji DNA. Do tego celu można wykorzystać dowolną tkankę biologiczną i ludzkie wydzieliny .
- Szczątki kostne
- Zęby
- Mieszki włosowe
- Krew
- Komórki nabłonkowe
- Pot
- Ślina
- Próbki spermy
- Odchody itp.
Biomateriał w magazynie dowodów może przetrwać dziesięciolecia. Często biegły pobiera do badania tylko część materiału, tyle ile potrzebuje do ekstrakcji DNA. Na przykład, jeśli na nożu znajdują się ślady krwi, ekspert nie zmywa całej krwi, ale wykonuje małe płukanie tuż przed ekstrakcją DNA. Pozostawia to ślady na nożu, które można wykorzystać do przeprowadzenia ponownego badania kilkadziesiąt lat później.
W jądrze komórkowym DNA jest w bliskim kontakcie z licznymi cząsteczkami organicznymi niezbędnymi do jego skutecznego funkcjonowania. Jednak w przypadku analizy genetycznej, węglowodany, lipidy i białka muszą zostać usunięte z badanej próbki, co może zmniejszyć wydajność stosowanych metod, a w konsekwencji wpłynąć na rozwiązywalność przestępstw.Ekstrakcja DNA zajmuje niewiele czasu dzięki różnorodnym komercyjnym zestawom i systemom zaprojektowanym specjalnie do ekstrakcji kwasów nukleinowych (np. AutoMate Express DNA Extraction System firmy Thermo Fisher Scientific). Ponadto, w dużych centrach kryminalistycznych, w których przeprowadza się tysiące analiz dziennie, proces ten jest w pełni zautomatyzowany i przeprowadzany z udziałem robotów pod nadzorem operatora.
Nawiasem mówiąc, systemy zrobotyzowane są szeroko stosowane nie tylko w laboratoriach kryminalistycznych, ale także w wielu ośrodkach medycznych i biotechnologicznych, pozwalając przyspieszyć proces, obniżyć koszty pracy i znacznie zmniejszyć ryzyko błędu.
Po ekstrakcji DNA rozpuszcza się w specjalnym związku, gdzie w razie potrzeby można go przechowywać przez lata (w temperaturze -20°C lub -80°C).
Analiza genetyczna
Natychmiast po ekstrakcji DnA specjalista staje przed pytaniem o dalsze sposoby jego analizy. Od czasu wprowadzenia identyfikacji DNA w kryminalistyce, techniki biologii molekularnej zmieniły się tak bardzo, że istnieje kilka możliwych wariantów. W dalszej części artykułu przedstawimy różne techniki analizy DNA, które eksperci kryminalistyki wykorzystują w swojej praktyce.
Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (analiza RFLP)
Analiza RFLP jest historycznie jedną z pierwszych metod identyfikacji DNA. Opiera się ona na wykorzystaniu specjalnych enzymów komórkowych, restryktaz. Enzymy restrykcyjne rozpoznają określone miejsca na cząsteczce kwasu nukleinowego i przecinają ją przez te miejsca. Do tej pory opisano kilka tysięcy takich enzymów. Po przecięciu cząsteczki DnA enzymami restrykcyjnymi, długość uzyskanych fragmentów ocenia się za pomocą elektroforezy żelowej (Rysunek 9).
Natychmiast po ekstrakcji DnA specjalista staje przed pytaniem o dalsze sposoby jego analizy. Od czasu wprowadzenia identyfikacji DNA w kryminalistyce, techniki biologii molekularnej zmieniły się tak bardzo, że istnieje kilka możliwych wariantów. W dalszej części artykułu przedstawimy różne techniki analizy DNA, które eksperci kryminalistyki wykorzystują w swojej praktyce.
Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (analiza RFLP)
Analiza RFLP jest historycznie jedną z pierwszych metod identyfikacji DNA. Opiera się ona na wykorzystaniu specjalnych enzymów komórkowych, restryktaz. Enzymy restrykcyjne rozpoznają określone miejsca na cząsteczce kwasu nukleinowego i przecinają ją przez te miejsca. Do tej pory opisano kilka tysięcy takich enzymów. Po przecięciu cząsteczki DnA enzymami restrykcyjnymi, długość uzyskanych fragmentów ocenia się za pomocą elektroforezy żelowej (Rysunek 9).
Ponieważ nie ma całkowicie identycznych genomów ludzkich (z wyjątkiem identycznych bliźniąt), różnica lub podobieństwo w uzyskanych profilach długości fragmentów DNA może być dobrym markerem zarówno do identyfikacji osobistej, jak i określania pokrewieństwa.
Jednak metoda ta obejmuje fragmentację DNA, a zatem jest wrażliwa na jakość i ilość oryginalnego materiału genetycznego. Dlatego analiza RFLP nie jest obecnie praktycznie stosowana - w przeciwieństwie do innych metod, które zostaną omówione poniżej.
Analiza liczby powtórzeń tandemowych w genomie
Powtórzenia tandemowe to kopie tej samej krótkiej sekwencji DnA powtarzane jedna po drugiej [15]. Powtórzenia, które są interesujące dla naukowców zajmujących się kryminalistyką, obejmują loci ze zmienną liczbą powtórzeń tandemowych (VNTR) i krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Są one również nazywane odpowiednio minisatelitami i mikrosatelitami.
Istotą tej metody jest amplifikacja PCR fragmentów DNA zawierających te krótkie powtarzające się sekwencje, których długości są różne u dwóch losowo wybranych osób. Po amplifikacji długość uzyskanych fragmentów jest oceniana za pomocą elektroforezy żelowej lub kapilarnej.
Do tego celu można wykorzystać zestaw Quantifiler DNA Quantification Kit i system QuantStudio firmy Termo Fisher Scientific. QuantStudio to kompaktowe urządzenie stacjonarne o szerokim zakresie funkcji.
Podobnie jak w przypadku poprzedniej metody, głównym czynnikiem identyfikującym test STR jest długość uzyskanych fragmentów, która jest unikalna dla każdej osoby i zależy od liczby powtórzeń w analizowanym miejscu. Analiza STR charakteryzuje się wysoką dokładnością i szybkością, a także niskim kosztem. Jakość materiału genetycznego jest ważnym warunkiem analizy.
Jednak metoda ta obejmuje fragmentację DNA, a zatem jest wrażliwa na jakość i ilość oryginalnego materiału genetycznego. Dlatego analiza RFLP nie jest obecnie praktycznie stosowana - w przeciwieństwie do innych metod, które zostaną omówione poniżej.
Analiza liczby powtórzeń tandemowych w genomie
Powtórzenia tandemowe to kopie tej samej krótkiej sekwencji DnA powtarzane jedna po drugiej [15]. Powtórzenia, które są interesujące dla naukowców zajmujących się kryminalistyką, obejmują loci ze zmienną liczbą powtórzeń tandemowych (VNTR) i krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Są one również nazywane odpowiednio minisatelitami i mikrosatelitami.
Istotą tej metody jest amplifikacja PCR fragmentów DNA zawierających te krótkie powtarzające się sekwencje, których długości są różne u dwóch losowo wybranych osób. Po amplifikacji długość uzyskanych fragmentów jest oceniana za pomocą elektroforezy żelowej lub kapilarnej.
Do tego celu można wykorzystać zestaw Quantifiler DNA Quantification Kit i system QuantStudio firmy Termo Fisher Scientific. QuantStudio to kompaktowe urządzenie stacjonarne o szerokim zakresie funkcji.
Podobnie jak w przypadku poprzedniej metody, głównym czynnikiem identyfikującym test STR jest długość uzyskanych fragmentów, która jest unikalna dla każdej osoby i zależy od liczby powtórzeń w analizowanym miejscu. Analiza STR charakteryzuje się wysoką dokładnością i szybkością, a także niskim kosztem. Jakość materiału genetycznego jest ważnym warunkiem analizy.
Analiza STR pojawiła się w praktycznej kryminalistyce prawie dwadzieścia lat temu, ale do dziś pozostaje główną metodą identyfikacji osób. Wyniki analizy DNA podejrzanych i przestępców - profile genetyczne - są wprowadzane przez kryminologów do specjalnych baz danych.
W związku z tym, gdy na miejscach zbrodni znajdują się ślady biologiczne, z których można wyizolować DNA, możliwe stało się zidentyfikowanie wszystkich osób, które już zwróciły uwagę organów ścigania. Te same markery są wykorzystywane do poszukiwania osób zaginionych i ustalania ojcostwa.
W związku z tym, gdy na miejscach zbrodni znajdują się ślady biologiczne, z których można wyizolować DNA, możliwe stało się zidentyfikowanie wszystkich osób, które już zwróciły uwagę organów ścigania. Te same markery są wykorzystywane do poszukiwania osób zaginionych i ustalania ojcostwa.
Z reguły systemy zaprojektowane do identyfikacji osób pozwalają na analizę kilku loci genomu (10-24) jednocześnie, w tym genu białka amelogeniny, na podstawie którego określa się płeć. Gen amelogeniny znajduje się zarówno na chromosomie X, jak i Y, ale różni się wielkością, co pozwala na określenie płci danej osoby.
Dzięki zastosowaniu technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, kryminalistyka uzyskała skuteczne narzędzie, które otworzyło nowe możliwości jednoczesnej analizy wielu miejsc (loci) genomu jądrowego i mitochondrialnego.
Ważną zaletą tych metod jest możliwość rozróżnienia nawet identycznych bliźniąt (na podstawie mutacji somatycznych), co jest niemożliwe w przypadku analizy RFLP lub STR.
Dzięki zastosowaniu technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, kryminalistyka uzyskała skuteczne narzędzie, które otworzyło nowe możliwości jednoczesnej analizy wielu miejsc (loci) genomu jądrowego i mitochondrialnego.
Ważną zaletą tych metod jest możliwość rozróżnienia nawet identycznych bliźniąt (na podstawie mutacji somatycznych), co jest niemożliwe w przypadku analizy RFLP lub STR.
W drugiej części tej publikacji opiszemy, w jaki sposób opisane powyżej metody można wykorzystać do identyfikacji laboratoriów narkotykowych i dilerów narkotyków oraz jak można zmylić kryminalistyków, czyszcząc swoje ślady.
Przeczytaj CZĘŚĆ II
