Εισαγωγή
Η L-φαινυλακετυλοκαρβινόλη είναι μια ένωση που χρησιμοποιείται στη σύνθεση της εφεδρίνης, η οποία η ίδια χρησιμοποιείται ως πρόδρομη ουσία των αμφεταμινών. Βιομηχανικά, συντίθεται με την αερόβια ζύμωση της βενζαλδεΰδης από μαγιά αρτοποιίας (S. cerevisiae/SC). Ενώ η διαδικασία είναι αρκετά απλή, μπορεί να απαιτεί λίγο εξοπλισμό και γνώσεις, ειδικά όταν μιλάμε για τη διατήρηση αποστειρωμένων καλλιεργειών και κατάλληλων συνθηκών ανάπτυξης. Επομένως, θα εξηγήσω δύο μεθόδους διαφορετικής πολυπλοκότητας για την παραγωγή L-PAC μέσω βιομετασχηματισμού. Το μέσο ανάπτυξης πρέπει να αποστειρώνεται με αυτόκαυστο πριν από τη χρήση.
Πρώτη μέθοδος:
Θα μπορούσε κανείς να περιγράψει αυτή την τεχνική ως "πρόχειρη αλλά εύκολη". Απαιτεί λιγότερο εξοπλισμό, είναι ευκολότερη, αλλά είναι επίσης λιγότερο αποτελεσματική και θα οδηγήσει σε χαμηλότερες αποδόσεις.
Διαδικασία:
Σε 500ml αποστειρωμένου ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού άλατος 0,1M pH 6 προσθέστε 44g ζύμης και 55g γλυκόζης. Τοποθετήστε σε υδατόλουτρο θερμαινόμενο στους 30°C. Επώαση για 40/50 λεπτά.
Προσθέστε βενζαλδεΰδη (25 mmol) σε 5 ml αιθανόλης και ακεταλδεΰδη (25 mmol). Επώαση για 60 λεπτά.
Φιλτράρετε μέσω Celite.
Εκχυλίστε με 3*100 ml οξικού αιθυλεστέρα. Σπάστε το γαλάκτωμα χρησιμοποιώντας κορεσμένο διάλυμα χλωριούχου νατρίου, στεγνώστε πάνω σε άνυδρο θειικό νάτριο, διηθήστε, εξατμίστε το διαλύτη. Αυτό είναι το L-PAC σας.
Επεξηγήσεις:
Κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα: χρησιμοποιείται για τη διατήρηση σταθερού pH, καθώς η ανάπτυξη του κυττάρου θα το μειώσει με την πάροδο του χρόνου (όχι καλό). Για να προετοιμάσετε αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα, ακολουθήστε τις διαδικασίες που δίνονται από αυτόν τον υπολογιστή: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Μην ξεχάσετε να αλλάξετε το pH σε 6.
Θερμοκρασία: επιτρέπει υψηλότερη μεταβολική δραστηριότητα της ζύμης.
Αιθανόλη: χρησιμοποιείται για τη διάλυση της βενζαλδεΰδης και της ακεταλδεΰδης και αυξάνει τη βιοδιαθεσιμότητά τους.
Ακεταλδεΰδη: χρησιμοποιείται ως δέκτης υδρογόνου αντί της βενζαλδεΰδης, περιορίζοντας έτσι την παραγωγή βενζυλικής αλκοόλης.
Πρόκειται για μια εύκολη διαδικασία που σχεδόν ο καθένας μπορεί να ακολουθήσει μετά από λίγο διάβασμα σχετικά με τις τυποποιημένες αποστειρωμένες τεχνικές, αλλά δίνει χαμηλότερες αποδόσεις από την άλλη (μεταξύ 20 και 40%). Μπορεί να βελτιωθεί είτε με καλύτερο αερισμό χρησιμοποιώντας είτε τροχιακή ανακίνηση στις 150 στροφές ανά λεπτό είτε με άντληση αποστειρωμένου αέρα στο μέσο, με 1L αέρα ανά λίτρο μέσου ανά λεπτό, είτε με ακινητοποίηση των κυττάρων σε αλγινικά σφαιρίδια. Μπορείτε να το αναζητήσετε αυτό στο youtube, είναι πολύ εύκολο να γίνει και μπορεί να αυξήσει σημαντικά τις αποδόσεις.
Δεύτερη μέθοδος:
Αυτό το πρωτόκολλο είναι πιο προχωρημένο, αλλά μπορεί να αυξήσει τις αποδόσεις έως και 60 ή 70% αν γίνει σωστά. Ωστόσο, θα απαιτήσει περισσότερο υλικό. Παρόλο που δεν είναι τέλειο, είναι πολύ καλύτερο.
Αυτή η μέθοδος σχεδιάστηκε για τον ζυμομύκητα Candida utilis αντί για τον S. cerevisiae. Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε SC αντί αυτής, αλλά θα δείτε μείωση των αποδόσεων. Μπορείτε να αγοράσετε το C. utilis εδώ: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Διαδικασία
Το μέσο ανάπτυξης αποτελείται από 10g/L ουρίας (φέρνει άζωτο), 10g/L MgSO4 (φέρνει μαγνήσιο και θείο) και από 50 έως 70g/L ζάχαρης χρησιμοποιώντας μελάσα. Διαλύεται σε επαρκή όγκο ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικών 0,1M pH 6.
Την προηγούμενη ημέρα, εμβολιάστε μια αρχική καλλιέργεια ζύμης και επωάστε στους 30°C κατά τη διάρκεια της νύχτας.
Μετρήστε την οπτική πυκνότητα (απορρόφηση) στα 595nm. Εμβολιάστε τον αντιδραστήρα ζύμωσης με 15% v/v της αρχικής σας καλλιέργειας προσαρμοσμένης σε 0,4 OD. Παράδειγμα: για να εμβολιάσετε ένα δοχείο 1L, εάν η OD μετρήθηκε σε 0,2, προσθέστε 300mL σε 700mL. Εάν η OD είναι ήδη στο 0,4, προσθέστε 150mL στα 850mL κ.λπ... (240x106 κύτταρα/ml στο εμβόλιο, βλέπε επεξηγήσεις)
Επώαση στους 30°C είτε με τροχιακή ανακίνηση στις 150 στροφές ανά λεπτό είτε με άντληση αποστειρωμένου αέρα με ρυθμό 1 v/v/min. Εάν αντλείτε αέρα, ίσως να θέλετε να προσθέσετε κάποια αργή ανάδευση.
Επωάστε μέχρι η OD να φτάσει μεταξύ 0,3 και 0,4. Αυτό θα πρέπει να διαρκέσει από 4 έως 6 ώρες, μπορεί να είναι λιγότερο ή περισσότερο. Ελέγχετε την OD κάθε 30 λεπτά μέχρι να φτάσετε στην επιθυμητή τιμή.
Η προσθήκη της βενζαλδεΰδης γίνεται σε πολλαπλές δόσεις. Για ένα 50mL, οι όγκοι είναι 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Προσθέστε ταυτόχρονα έναν ισοδύναμο όγκο ακεταλδεΰδης. Περιμένετε μία ώρα μεταξύ κάθε προσθήκης.
Εκχυλίστε χρησιμοποιώντας 1:2 τολουόλιο/μέσο v/v, εξατμίστε.
Επεξήγηση:
Οπτική πυκνότητα: μετράται με φασματοφωτόμετρο. Εδώ διαβάζουμε την απορρόφηση στα 595nm, η οποία είναι ανάλογη του αριθμού των κυττάρων στο διάλυμα. Ως γενικός κανόνας, θυμηθείτε 0,1 OD=60x10^6 κύτταρα/ml
Γενικές σημειώσεις:
Για τον αερισμό, σε μικρή κλίμακα η τροχιακή ανακίνηση στις 150 στροφές ανά λεπτό είναι καλύτερη. Σε μεγαλύτερη κλίμακα, θα χρειαστεί να κάνετε φυσαλίδες αέρα που περνάει από φίλτρο.
Στο δεύτερο πρωτόκολλο, η προσθήκη βενζαλδεΰδης γίνεται σε πολλαπλές δόσεις για να αυξηθούν οι αποδόσεις. Αυτό μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω με συνεχή έγχυση βενζαλδεΰδης με φθίνοντα ρυθμό, αλλά αυτό είναι περίπλοκο να γίνει σε ερασιτεχνικό περιβάλλον.
Μπορούν να χρησιµοποιηθούν υποκατεστηµένες βενζαλδεΰδες και να αποδώσουν το αντίστοιχο ανάλογο L-PAC.
Τέλος, μπορείτε να δανειστείτε ορισμένα στοιχεία της μεθόδου 2 και να τα ενσωματώσετε στη μέθοδο 1, προκειμένου να προσαρμόσετε τον πειραματικό σχεδιασμό στα μέτρα σας. Λάβετε υπόψη ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα στελέχη και είδη, αυξάνοντας σημαντικά τις αποδόσεις. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στην ενότητα "Παραγωγή L-φαινυλοακετυλοκαρβινόλης (L-PAC) από διάφορα νέα στελέχη ζυμομυκήτων σε μελάσα και χυμό ζαχαροκάλαμου ως μέσο παραγωγής" των Ravi et al.
Η L-φαινυλακετυλοκαρβινόλη είναι μια ένωση που χρησιμοποιείται στη σύνθεση της εφεδρίνης, η οποία η ίδια χρησιμοποιείται ως πρόδρομη ουσία των αμφεταμινών. Βιομηχανικά, συντίθεται με την αερόβια ζύμωση της βενζαλδεΰδης από μαγιά αρτοποιίας (S. cerevisiae/SC). Ενώ η διαδικασία είναι αρκετά απλή, μπορεί να απαιτεί λίγο εξοπλισμό και γνώσεις, ειδικά όταν μιλάμε για τη διατήρηση αποστειρωμένων καλλιεργειών και κατάλληλων συνθηκών ανάπτυξης. Επομένως, θα εξηγήσω δύο μεθόδους διαφορετικής πολυπλοκότητας για την παραγωγή L-PAC μέσω βιομετασχηματισμού. Το μέσο ανάπτυξης πρέπει να αποστειρώνεται με αυτόκαυστο πριν από τη χρήση.
Πρώτη μέθοδος:
Θα μπορούσε κανείς να περιγράψει αυτή την τεχνική ως "πρόχειρη αλλά εύκολη". Απαιτεί λιγότερο εξοπλισμό, είναι ευκολότερη, αλλά είναι επίσης λιγότερο αποτελεσματική και θα οδηγήσει σε χαμηλότερες αποδόσεις.
Διαδικασία:
Σε 500ml αποστειρωμένου ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού άλατος 0,1M pH 6 προσθέστε 44g ζύμης και 55g γλυκόζης. Τοποθετήστε σε υδατόλουτρο θερμαινόμενο στους 30°C. Επώαση για 40/50 λεπτά.
Προσθέστε βενζαλδεΰδη (25 mmol) σε 5 ml αιθανόλης και ακεταλδεΰδη (25 mmol). Επώαση για 60 λεπτά.
Φιλτράρετε μέσω Celite.
Εκχυλίστε με 3*100 ml οξικού αιθυλεστέρα. Σπάστε το γαλάκτωμα χρησιμοποιώντας κορεσμένο διάλυμα χλωριούχου νατρίου, στεγνώστε πάνω σε άνυδρο θειικό νάτριο, διηθήστε, εξατμίστε το διαλύτη. Αυτό είναι το L-PAC σας.
Επεξηγήσεις:
Κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα: χρησιμοποιείται για τη διατήρηση σταθερού pH, καθώς η ανάπτυξη του κυττάρου θα το μειώσει με την πάροδο του χρόνου (όχι καλό). Για να προετοιμάσετε αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα, ακολουθήστε τις διαδικασίες που δίνονται από αυτόν τον υπολογιστή: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Μην ξεχάσετε να αλλάξετε το pH σε 6.
Θερμοκρασία: επιτρέπει υψηλότερη μεταβολική δραστηριότητα της ζύμης.
Αιθανόλη: χρησιμοποιείται για τη διάλυση της βενζαλδεΰδης και της ακεταλδεΰδης και αυξάνει τη βιοδιαθεσιμότητά τους.
Ακεταλδεΰδη: χρησιμοποιείται ως δέκτης υδρογόνου αντί της βενζαλδεΰδης, περιορίζοντας έτσι την παραγωγή βενζυλικής αλκοόλης.
Πρόκειται για μια εύκολη διαδικασία που σχεδόν ο καθένας μπορεί να ακολουθήσει μετά από λίγο διάβασμα σχετικά με τις τυποποιημένες αποστειρωμένες τεχνικές, αλλά δίνει χαμηλότερες αποδόσεις από την άλλη (μεταξύ 20 και 40%). Μπορεί να βελτιωθεί είτε με καλύτερο αερισμό χρησιμοποιώντας είτε τροχιακή ανακίνηση στις 150 στροφές ανά λεπτό είτε με άντληση αποστειρωμένου αέρα στο μέσο, με 1L αέρα ανά λίτρο μέσου ανά λεπτό, είτε με ακινητοποίηση των κυττάρων σε αλγινικά σφαιρίδια. Μπορείτε να το αναζητήσετε αυτό στο youtube, είναι πολύ εύκολο να γίνει και μπορεί να αυξήσει σημαντικά τις αποδόσεις.
Δεύτερη μέθοδος:
Αυτό το πρωτόκολλο είναι πιο προχωρημένο, αλλά μπορεί να αυξήσει τις αποδόσεις έως και 60 ή 70% αν γίνει σωστά. Ωστόσο, θα απαιτήσει περισσότερο υλικό. Παρόλο που δεν είναι τέλειο, είναι πολύ καλύτερο.
Αυτή η μέθοδος σχεδιάστηκε για τον ζυμομύκητα Candida utilis αντί για τον S. cerevisiae. Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε SC αντί αυτής, αλλά θα δείτε μείωση των αποδόσεων. Μπορείτε να αγοράσετε το C. utilis εδώ: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Διαδικασία
Το μέσο ανάπτυξης αποτελείται από 10g/L ουρίας (φέρνει άζωτο), 10g/L MgSO4 (φέρνει μαγνήσιο και θείο) και από 50 έως 70g/L ζάχαρης χρησιμοποιώντας μελάσα. Διαλύεται σε επαρκή όγκο ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικών 0,1M pH 6.
Την προηγούμενη ημέρα, εμβολιάστε μια αρχική καλλιέργεια ζύμης και επωάστε στους 30°C κατά τη διάρκεια της νύχτας.
Μετρήστε την οπτική πυκνότητα (απορρόφηση) στα 595nm. Εμβολιάστε τον αντιδραστήρα ζύμωσης με 15% v/v της αρχικής σας καλλιέργειας προσαρμοσμένης σε 0,4 OD. Παράδειγμα: για να εμβολιάσετε ένα δοχείο 1L, εάν η OD μετρήθηκε σε 0,2, προσθέστε 300mL σε 700mL. Εάν η OD είναι ήδη στο 0,4, προσθέστε 150mL στα 850mL κ.λπ... (240x106 κύτταρα/ml στο εμβόλιο, βλέπε επεξηγήσεις)
Επώαση στους 30°C είτε με τροχιακή ανακίνηση στις 150 στροφές ανά λεπτό είτε με άντληση αποστειρωμένου αέρα με ρυθμό 1 v/v/min. Εάν αντλείτε αέρα, ίσως να θέλετε να προσθέσετε κάποια αργή ανάδευση.
Επωάστε μέχρι η OD να φτάσει μεταξύ 0,3 και 0,4. Αυτό θα πρέπει να διαρκέσει από 4 έως 6 ώρες, μπορεί να είναι λιγότερο ή περισσότερο. Ελέγχετε την OD κάθε 30 λεπτά μέχρι να φτάσετε στην επιθυμητή τιμή.
Η προσθήκη της βενζαλδεΰδης γίνεται σε πολλαπλές δόσεις. Για ένα 50mL, οι όγκοι είναι 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Προσθέστε ταυτόχρονα έναν ισοδύναμο όγκο ακεταλδεΰδης. Περιμένετε μία ώρα μεταξύ κάθε προσθήκης.
Εκχυλίστε χρησιμοποιώντας 1:2 τολουόλιο/μέσο v/v, εξατμίστε.
Επεξήγηση:
Οπτική πυκνότητα: μετράται με φασματοφωτόμετρο. Εδώ διαβάζουμε την απορρόφηση στα 595nm, η οποία είναι ανάλογη του αριθμού των κυττάρων στο διάλυμα. Ως γενικός κανόνας, θυμηθείτε 0,1 OD=60x10^6 κύτταρα/ml
Γενικές σημειώσεις:
Για τον αερισμό, σε μικρή κλίμακα η τροχιακή ανακίνηση στις 150 στροφές ανά λεπτό είναι καλύτερη. Σε μεγαλύτερη κλίμακα, θα χρειαστεί να κάνετε φυσαλίδες αέρα που περνάει από φίλτρο.
Στο δεύτερο πρωτόκολλο, η προσθήκη βενζαλδεΰδης γίνεται σε πολλαπλές δόσεις για να αυξηθούν οι αποδόσεις. Αυτό μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω με συνεχή έγχυση βενζαλδεΰδης με φθίνοντα ρυθμό, αλλά αυτό είναι περίπλοκο να γίνει σε ερασιτεχνικό περιβάλλον.
Μπορούν να χρησιµοποιηθούν υποκατεστηµένες βενζαλδεΰδες και να αποδώσουν το αντίστοιχο ανάλογο L-PAC.
Τέλος, μπορείτε να δανειστείτε ορισμένα στοιχεία της μεθόδου 2 και να τα ενσωματώσετε στη μέθοδο 1, προκειμένου να προσαρμόσετε τον πειραματικό σχεδιασμό στα μέτρα σας. Λάβετε υπόψη ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα στελέχη και είδη, αυξάνοντας σημαντικά τις αποδόσεις. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στην ενότητα "Παραγωγή L-φαινυλοακετυλοκαρβινόλης (L-PAC) από διάφορα νέα στελέχη ζυμομυκήτων σε μελάσα και χυμό ζαχαροκάλαμου ως μέσο παραγωγής" των Ravi et al.
